MultiNA有效提高Cas9檢測靈敏度和編輯效率評估
從鋅指核酸酶內(nèi)切酶（ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）到第三代基因組定點編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，再到5月份中國河北科技大學(xué)韓春雨老師發(fā)表在Nature Biotechnology上采用的NgAgo/gDNA方法，基因編輯技術(shù)受到的關(guān)注與日俱增。在“如何進(jìn)行基因編輯”這個問題被解釋得不能再詳細(xì)的時候，我們是不是應(yīng)該考慮一下，如何評價基因編輯的結(jié)果呢？今天，我們就來說說評估基因編輯效率的方法。
首先，咱們來看看基因編輯之后，在基因組上都會發(fā)生哪些事情：
1. 首先，工具分子切割目的基因后，會在靶點留下雙鏈斷裂（DSB）；
2．隨后，細(xì)胞會針對DSB做出三種不同的修復(fù)方式：
① 完美修復(fù)：由同源重組（HR）或非同源末端連接（NHEJ）方式進(jìn)行的無痕修復(fù)。這類修復(fù)發(fā)生時，相當(dāng)于基因序列沒有發(fā)生變化，因此是不能檢測到基因編輯效率的；
② 插入修復(fù)：基于HR原理，并利用外源導(dǎo)入的Donor模板完成的序列插入修復(fù)。這類修復(fù)發(fā)生時，在靶點處會多出一段序列，相當(dāng)于完美地向基因組中整合了另外一段基因序列，并且可以通過DNA測序進(jìn)行檢測；
③ 隨機(jī)修復(fù)：基于NHEJ原理發(fā)生的錯誤修復(fù)。這類修復(fù)導(dǎo)致的后果可以說非常復(fù)雜，既可以是堿基插入，也可以是堿基缺失，而且數(shù)量隨機(jī)，毫無規(guī)律可循，因此是較難檢測一種基因編輯結(jié)果；
目前，用于分析基因編輯實驗結(jié)果的方法主要有大批量亞克隆PCR產(chǎn)物Sanger測序、HRM分析、二代測序(NGS) 和數(shù)字PCR(GEF-dPCR)方法。然而這些方法均有令人煩惱的短板，如Sanger測序法耗時太久，HRM分析、NGS和GEF-dPCR對設(shè)備、樣品、實驗成本及數(shù)據(jù)量有較為苛刻的要求。
那到底有沒有一種既花費成本低、又比較可靠的方法和工具呢？
答案是肯定的！
下面介紹一種，利用異源雙鏈泳動實驗(HMA)來檢測上述基因編輯效率的工具：高靈敏、自動化微芯片電泳系統(tǒng)。
HMA的實驗流程
異源雙鏈DNA依賴于分子量進(jìn)行電泳泳動，同時異源雙鏈部分區(qū)域發(fā)生錯配，導(dǎo)致與同源雙鏈的結(jié)構(gòu)差異，空間結(jié)構(gòu)也會影響泳動速率，因此，通過分離異源雙鏈與同源雙鏈，微芯片電泳系統(tǒng)可以檢測有沒有發(fā)生突變。
檢測步驟：
1. 運(yùn)用基因編輯工具將野生型小鼠基因改造成多色F0代小鼠：
2. F0 與野生型回交，形成野生和雜合F1代：
3. F1自交形成野生、純合變異、雜合F2代：
4. 取F0、F1、F2代小鼠，對發(fā)生突變的目的基因片段進(jìn)行PCR；
5. 在熱循環(huán)中，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行熱變性與冷復(fù)性，制作出異源雙鏈DNA；
6. 用微芯片電泳系統(tǒng)分離檢測異源雙鏈DNA；
（在熱變性、復(fù)性之后，由兩種結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物變成4種結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物）
HMA-MultiNA微芯片電泳檢測結(jié)果
F0代TALEN突變形成評價
注：活性百分比為B/A的相對活性
HMA-MultiNA檢測是用兩種類型TALENS來處理相同基因四個個體。當(dāng)多色個體用HMA來檢測時，因為大量異源雙鏈的出現(xiàn)，在野生型條帶的上面有彌散的條帶類型，所以，通過計算野生型條帶的數(shù)量以及彌散條帶的數(shù)量比值，即得到TALEN突變率。在此結(jié)果中，實驗二野生型條帶含量低，所以可知TALEN 2的體內(nèi)活性更高。
F1代HMA-MultiNA與測序結(jié)果對比
F1代有多樣的條帶缺失大小，條帶類型也很多。通過HMA-MultiNA檢測結(jié)果如上圖左，缺失片段的測序結(jié)果如上圖右�？芍�，HMA-MultiNA可以在175bp的產(chǎn)物大小中檢測到2bp的缺失，同時直接檢測到4bp缺失片段的純合變異體，此外有可能從條帶類型得到缺失條帶大小。
F2代HMA-MultiNA基因分型
結(jié)果可知，異源雙鏈中的一條鏈有8bp的缺失，可以清晰的分離開雜合體的四種條帶。同時，從條帶分離中，可以確定野生型和純合突變體。
即使變異程度很小，很難判定哪個是純合突變體，仍然可以利用野生型的PCR產(chǎn)物加入到表示單獨條帶的PCR產(chǎn)物中，進(jìn)行第二次HMA實驗，來再次檢測異源雙鏈DNA，以發(fā)現(xiàn)具有很小缺失的純合突變體。
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MultiNA是將先進(jìn)的微芯片技術(shù)和自動化分析技術(shù)完美結(jié)合，締造出的全新DNA/RNA快速分析系統(tǒng)，2007年度獲得世界十大新產(chǎn)品獎。與傳統(tǒng)的瓊脂糖電泳技術(shù)相比，費用更低、速度更快、靈敏度更高，使電泳分析進(jìn)入新境界。 為生命科學(xué)帶來了突破性的變革！
2015年，MultiNA已經(jīng)越來越廣泛用于基因編輯領(lǐng)域，在日本市場，已售出200臺。
MultiNA微芯片電泳系統(tǒng)特點：
1、 LED激發(fā)熒光檢測器，靈敏度是傳統(tǒng)方法的10倍；
2、 芯片既可做DNA樣品，又可做RNA樣品，可重復(fù)使用；
3、 最多支持4張芯片同時工作，大大提高工作效率；
4、 單管、8邊管、96孔板均可自由獨立取樣分析；
5、 配套高品質(zhì)試劑保持期長，分析成本低；
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