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細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Wound Healing)是一種操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗(yàn)方法。這種方法的原理是，當(dāng)細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”，劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合，在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程，是研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)中最簡單的方法。

劃痕實(shí)驗(yàn)中，檢測目標(biāo)為感染病毒后表達(dá)熒光蛋白的目的細(xì)胞[不表達(dá)熒光蛋白也可以，但是圖片得視覺效果不如表達(dá)熒光蛋白] （生長于96孔板中）。用專用的劃痕工具制造劃痕，細(xì)胞成像系統(tǒng)識別帶綠色熒光的細(xì)胞并拍照（即讀板）。然后通過軟件對同一視野細(xì)胞遷移0h和x h（x為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞合適的遷移時(shí)間點(diǎn)[時(shí)間太早，劃痕愈合的效果不明顯，時(shí)間太長，不同組別的劃痕都愈合完成，組間看不到差異，推薦時(shí)間點(diǎn)為0h、8h、16h、24h、36h、48h] ）后圖像進(jìn)行分析處理，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在x h的遷移面積。

（1）將處于對數(shù)生長期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；

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（2）根據(jù)細(xì)胞大小決定鋪板細(xì)胞密度（大多數(shù)細(xì)胞鋪板數(shù)設(shè)定為50000 cell/well，以次日細(xì)胞達(dá)到90%以上匯合度為準(zhǔn)[細(xì)胞鋪的太多，太擠，連原本細(xì)胞形態(tài)都會看不清。劃的時(shí)候，也很容易劃不干凈，而且劃完以后，兩邊會掛有一團(tuán)團(tuán)細(xì)胞，使兩邊邊界不清晰。不同細(xì)胞，形態(tài)大小不一，鋪板細(xì)胞量自然也就不一樣，想要找出鋪板最佳細(xì)胞量，最快捷的方法就是鋪梯度。96孔板，那么多孔，足夠一次鋪好幾個密度梯度了（3萬，5萬，10萬，隨便試）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組3復(fù)孔，培養(yǎng)體系為100 μL/孔。

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（4）使用PBS輕輕漂洗2-3遍[劃完以后，痕中間和培養(yǎng)液中遺落少量細(xì)胞，是可以通過清洗去除的（如果太多，就別掙扎了，重新再來吧），有些是已經(jīng)被劃動了，但沒有完全劃掉，這時(shí)候清洗個兩三次，清洗的時(shí)候輕拍96孔板，已經(jīng)被劃動的貼壁不牢的細(xì)胞大多數(shù)會別洗掉。不過，對于一些本身就容易脫落的細(xì)胞，就不能這樣洗了，只能“溫柔以待”，以免細(xì)胞全被洗沒了。] ，加入低濃度血清培養(yǎng)基（如1% FBS）[使用低濃度的培養(yǎng)基是為了防止細(xì)胞增殖對劃痕結(jié)果的影響] ，0 h拍照。

（5） 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)愈合程度選擇合適時(shí)間用細(xì)胞成像設(shè)備掃板。

五、吉凱劃痕數(shù)據(jù)分析步驟[不同的細(xì)胞成像設(shè)備使用不同的分析方法，八仙過海各顯神通吧，但是整體思路就是比面積、比寬度]

（1）在0 h和x h對目標(biāo)96孔板進(jìn)行掃描讀板，獲得掃描圖片；

下圖為針對同一視野在遷移0 h和20 h后獲得的掃描圖像示例（細(xì)胞為H1299）：

（2）用YOKOGAWA CQ1激光共聚焦細(xì)胞分析儀或者帶有分析功能的倒置顯微鏡（吉盛醫(yī)學(xué)提供）對掃描圖片進(jìn)行分析，自動獲得數(shù)據(jù)獲得細(xì)胞面積。

（4）針對劃痕預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)遷移面積，判斷細(xì)胞是否有愈合能力；針對劃痕實(shí)驗(yàn)，根據(jù)遷移面積，判斷相對陰性對照組，KD（或OE）組細(xì)胞愈合能力的差異。

CQ1 活細(xì)胞共聚焦顯微鏡（吉盛醫(yī)學(xué)提供） NIB倒置活細(xì)胞熒光顯微鏡（吉盛醫(yī)學(xué)提供）

六、質(zhì)量控制：

1、正式實(shí)驗(yàn)每個孔采集3張照片，照片要求劃痕寬度基本一致，且劃痕的面積內(nèi)無遺留較多的細(xì)胞或者痕跡，圖片中的細(xì)胞分布均勻，且無大面積的凋亡（靶點(diǎn)本身導(dǎo)致的凋亡除外）；

2、如果在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了CON（空白）組，實(shí)驗(yàn)中CON和NC（陰性對照）組的遷移能力要基本一致；

3、細(xì)胞劃痕預(yù)實(shí)驗(yàn)基本從8h，16h，24h，36h，48h這幾個時(shí)間點(diǎn)間進(jìn)行選擇，但是具體進(jìn)行的時(shí)間點(diǎn)需要根據(jù)細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行調(diào)整；報(bào)告中的圖片不能在第1和第2個時(shí)間點(diǎn)就出現(xiàn)愈合。

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